Triplet excited species in biological systems - a visit to the \"photobiochemistry without light\" hypothesis from G. Cilento

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luzElectronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to ligh